7. How to check the quantity and quality of RNA

I. RNA quantity

1. Nanodrop

  • 原理:核酸及其衍生物具有共轭双键系统,能吸收紫光,RNA和DNA的紫外吸收峰在260nm波长处。一般在260nm波长下,每1ml含1ug RNA溶液的光吸收值为0.022~0.024,DNA为0.020,故测定位置浓度的RNA或DNA溶液在260nm处的光吸收值,即可计算出其中核酸的含量。

  • 优点:除检测核酸浓度外,还能通过计算A260/A280和A260/A230的数值,估计核酸的纯度(280 nm吸光通常来自蛋白质,而230 nm则通常来自糖类和苯酚等)。

  • 缺点:无法区分RNA、DNA、降解或游离的核酸及其他杂质。

  • 局限性:尽管是常用的DNA/RNA定量方法,但其读数并不可靠且不准确,不能用于后续建库的参考。且紫外吸收法对降解比较严重的核酸无能为力。

  • 测量范围:RNA浓度约为100 ng/ul时,SD为2ng/ul。

2. Qubit

  • 原理:采用荧光染料检测特定目标分子的浓度,molecular probes染料只有与DNA、RNA、或蛋白质这些特定靶分子结合,并在特定波长光源的激发下,发出荧光信号,即使有游离或降解的核苷酸存在时仍能克服背景噪音,精准定量。

  • 优点:高灵敏性、高特异性、高精确度,在样本浓度低的情况下,Qubit更为准确。

  • 适用性:Qubit定量技术对目标分子有高度的选择性,比如:Qubit检测双链DNA浓度时,特异性检测待测样本中的的双链DNA,对于样本中存在的单链DNA或者RNA不检测,这种特异性可以获得十分精确的结果。在新一代测序(NGS)实验中,对我们后续的精确建库过程也是很必要的。

  • 局限性:Qubit检测仅样品中DNA/RNA的量,不能获取吸光度读数以提供A260/A280比率或检测核酸样品中的蛋白质。

  • 操作方法(如下图):

1) 配置标准品并测量,仪器自动校正并生成标准曲线;

2) 配置检测样本,上机检测。

3. Nanodrop vs Qubit优劣比较

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核酸定量哪家强?

II. RNA quality

  • 评估RNA完整性是获得有意义基因表达数据的第一个关键步骤。采用完整的RNA是成功建立NGS文库或进行qRT-PCR实验的关键要素

  • RNA Integrity Number,RIN值,旨在标准化RNA质量控制过程,基于1至10的编号统,RIN软件算法可将真核生物总RNA分类,其中1代表降解最严重的情况,10代表最完整。

1. 紫外吸光度检测法

检测RNA溶液的吸光度280/320/230/260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景/溶液浑浊度、盐浓度和蛋白质等有机物的值。

可以通过看OD260/OD280的值R,1.8-2.0时,我们认为RNA中蛋白质或其他有机物的污染时可容忍的;当R2.2时,说明RNA已经水解成单核酸了。

2. RNA凝胶电泳法

核糖体RNA则占总RNA样品80%以上,其中大多数是由28S和18S rRNA组成的(在哺乳动物系统中),哺乳动物28S和18S rRNA的长度大约分别为5kb和2kb,所以理论上28S:18S的比率应该大约为2.7:1。

通过琼脂糖胶检测28S和28S条带的完整性和比值,如果28S和18S条带明亮、清晰、条带边缘清楚,并且28S的亮度在18S条带的两倍以上,我们认为RNA的质量较好。

但是因为rRNA条带的外观会受电泳条件、RNA上样量以及溴化乙锭荧光饱和度等条件的影响,准确性和稳定性低。

此外,使用变性凝胶电泳来评估RNA完整性的一个缺陷是需要至少200ng的RNA样品;但很多RNA样本浓度较低,该方法就不再适用。

3. Agilent 2100 Bioanalyzer(升级版为A2200)

  • A2100检测是基于芯片实验室技术的核酸分析系统,对RNA或DNA文库进行定量及定性的新一代质控方法。

  • 原理:通过微流控技术对样本进行分离,当给芯片加入电压时,样品便在芯片上的显微蚀刻管道中进行毛细管电泳;在样品流动过程中,不同核酸片段根据大小被分离;凝胶-染料基质中的荧光染料可嵌入核酸,通过激光激发荧光,使其被仪器检测到。

  • 定量:仪器根据收集到的荧光信号强度,并通过ladder各个条带(已知size和浓度)及其相对应的迁移时间,形成一个迁移时间和浓度的函数关系,并计算未知input核酸的浓度,对样品定量

  • 定性(完整性):提供总RNA、mRNA和小分子RNA数据,以及RNA完整度(RIN)。

  • 样本体积:1ul RNA溶液。

  • 优点:高度准确、数字化结果、快速高效、操作简便、耗样量少。

  • 操作步骤: 1)样品自样品孔处沿微通道移动; 2)样品被注入分离微通道; 3)样品组分通过电泳被分离; 4)各组分通过其荧光被检测并被转变成凝胶样图像(条带)和电泳图谱(峰)。

  • 适用性:Agilent 2100生物分析仪是一种可以对组成总RNA的主要组分进行更清晰评估的工具,还可以对它们随来源、时间及保存方式产生的变化进行评估。已经取代了繁琐的凝胶电泳技术成为RNA样品质量控制(QC)的行业标准。

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